№1, 2007 г.
№1, 2007 г.
ЛАУРЕАТЫ НОБЕЛЕВСКОЙ ПРЕМИИ 2006 ГОДА По физиологии или медицине - Э.Файер и К.Мэллоу
Нобелевская премия по физиологии или медицине за 2006 г. присуждена американским ученым - Э.Файеру и К.Мэллоу - “за открытие фундаментального явления РНК-интерференции - подавления экспрессии генов с помощью двуцепочечной РНК”.
Давно известно, что молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК), состоящей, как и ДНК, из последовательности нуклеотидов, осуществляют передачу генетической информации от ДНК для синтеза белков (матричные РНК) и собственно синтез белка (рибосомальные и транспортные РНК, которые сами не кодируют белок). Впоследствии были обнаружены и другие типы некодирующих РНК, которые выполняют в клетке множество различных функций. Настоящей сенсацией стало открытие Файера и Мэллоу, опубликовавших в 1998 г. в “Nature” результаты своих экспериментов: инъекция молекул двуцепочечной РНК (РНК в виде двух спаренных комплементарных цепей) в организм нематоды Caenorhabditis elegans приводит к эффективному и строго специфичному выключению (подавлению экспрессии) гена, нуклеотидная последовательность которого совпадает с нуклеотидной последовательностью введенной двуцепочечной РНК [1]. После выключения гена перестает образовываться кодируемый им белок и, следовательно, исчезает определенный признак; при этом другие гены организма продолжают работать. Поскольку в данном случае происходит “наложение” гомологичных по нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот, Файер и Мэллоу назвали это явление РНК-интерференцией (RNA interference, RNAi) по аналогии с интерференцией (наложением волн) в физике. Стало очевидным, что двуцепочечная РНК может быть использована для избирательного воздействия на определенный ген, и в руках исследователей появилась технология, позволяющая точечно нарушать работу генов.
Открытие РНК-интерференции, несомненно, одно из главных событий молекулярной биологии и генетики на рубеже веков, а наиболее важное следствие этого открытия - обнаружение новых фундаментальных механизмов, с помощью которых молекулы РНК могут влиять на экспрессию генов. Кроме того, в настоящее время этот подход уже широко применяется как лабораторный метод для выявления функций генов, в том числе и при изучении генома человека. Уже в ближайшем будущем могут появиться основанные на принципе РНК-интерференции лекарства нового поколения, действующие специфично на определенный ген и выключающие синтез кодируемого им белка. Такими мишенями РНК-интерференции могут быть, например, гены, активные в клетках опухолей, или гены, обеспечивающие размножение вирусов.
Необходимо отметить, что подавить экспрессию гена с помощью соответствующих ему по нуклеотидной последовательности РНК пытались не только Файер и Мэллоу. Еще в 1984 г. Г.Вайнтрауб предложил использовать для этих целей антисмысловую РНК (РНК, комплементарную матричной РНК) [2]. Предполагалось, что антисмысловая одноцепочечная РНК может спариваться с гомологичной по нуклеотидной последовательности матричной РНК и препятствовать ее трансляции (синтезу белка). Применение этого метода как раз и привело в 1998 г. Файера и Мэллоу к неожиданному наблюдению: инъекция контрольной смысловой РНК (совпадающей с матричной РНК по последовательности) в организм нематоды приводила к такому же эффекту, что и антисмысловой. Более тщательный анализ показал, что активный, нарушающий экспрессию, компонент - вовсе не смысловая или антисмысловая РНК, а двуцепочечная РНК (дцРНК), содержащаяся в обоих препаратах в виде примеси. Введение только дцРНК в организм нематоды привело к подавлению экспрессии гомологичного ей гена с несравненно большей эффективностью, чем инъекции смысловой или антисмысловой цепей РНК по отдельности.
Уже первые исследования РНК-интерференции, проведенные на нематоде, выявили важную особенность дцРНК - она способна действовать в очень низких концентрациях. По расчетам, эффективными оказываются концентрации, соответствующие всего нескольким молекулам дцРНК на клетку. Это могло объясняться каталитическим действием дцРНК на многие молекулы матричной РНК. Другими словами, в клетке существует “белковая машина” РНК-интерференции, которая, используя сигнал, полученный от дцРНК, способна обнаруживать и инактивировать в клетке матричную РНК, совпадающую по нуклеотидной последовательности с дцРНК.
В последующие два-три года было установлено, что дцРНК способна вызывать избирательное подавление экспрессии генов не только у нематоды, но и у самых разных организмов (дрозофилы, планарии, гидры, одноклеточной трипаносомы, растений, рыб) и, наконец, в 2001 г. РНК-интерференцию удалось применить в экспериментах с клетками млекопитающих и человека.
Одновременно начались исследования самого процесса РНК-интерференции с использованием как генетического, так и биохимического подходов. По мере выяснения действия дцРНК в клетках беспозвоночных животных оказалось, что феномен РНК-интерференции имеет много общего с другим явлением, обнаруженным за несколько лет до этого у растений, - косупрессией. Косупрессия была впервые описана в 1990 г. в ходе опытов по получению трансгенных растений. Была обнаружена парадоксальная закономерность: общий уровень экспрессии трансгенов может резко снижаться или даже полностью подавляться при увеличении числа их копий. Если трансгены гомологичны хозяйскому гену, то его экспрессия также подавляется. В 1999 г. английские генетики А.Гамильтон и Д.Баулкомб обнаружили, что в процессе косупрессии образуются короткие (около 20-25 нуклеотидов) молекулы РНК, соответствующие по последовательности введенным трансгенам [3].
Спустя некоторое время короткие РНК были выявлены при проведении РНК-интерференции в бесклеточных системах, созданных из эмбрионов или культуры клеток дрозофилы в лаборатории Ф.Шарпа (лауреата нобелевской премии 1993 г. за открытие явления сплайсинга РНК, “прерывистой структуры гена” [4]). Оказалось, что при инициации РНК-интерференции происходит нарезание длинной молекулы дцРНК на короткие (21-23-нуклеотидные РНК), называемые также siРНК (short interfering RNAs), а на следующем этапе осуществляется расщепление матричной РНК с совпадающей нуклеотидной последовательностью. Стало очевидным, что короткие РНК, образующиеся из длинных дцРНК дуплексов, - активная форма сигнала, действующее начало машины РНК-интерференции.
Механизм РНК-интерференции (слева) и структура белка Dicer [6].
Молекулы дцРНК могут представлять собой РНК-шпильку или две спаренные комплементарные друг другу цепи РНК. Длинные молекулы дцРНК нарезаются (процессируются) в клетке на короткие ферментом Dicer: один из его доменов специфически связывает конец молекулы дцРНК (отмечен звездочкой), при этом другой - производит разрывы (отмечены белыми стрелками) в обеих цепях дцРНК. В результате образуется двунитевая РНК длиной 20-25 нуклеотидов (siРНК), а Dicer переходит к следующему циклу разрезания дцРНК, связываясь с ее новообразованным концом. Эти siРНК могут включаться в состав комплекса, содержащего белок Argonaute (AGO). Одна из цепей siРНК в комплексе с белком AGO находит в клетке комплементарные ей молекулы матричной РНК (мРНК). AGO разрезает молекулы мРНК-мишени, в результате чего мРНК деградирует, или останавливает трансляцию мРНК на рибосоме. Короткие РНК могут также подавлять транскрипцию (синтез РНК) гомологичного им по нуклеотидной последовательности гена в ядре.В 2001 г. в лаборатории Г.Хэннона был охарактеризован фермент, образующий короткие РНК из дцРНК и получивший название Dicer (от англ. to dice - нарезать в форме кубиков) [5]. Сейчас известно, что белок Dicer одним из своих доменов может “заякорить” конец молекулы дцРНК, при этом другой домен, находящийся на расстоянии в 20-25 пар нуклеотидов, производит разрывы в обеих цепях дцРНК. Таким образом, Dicer действует как “молекулярная линейка”, безошибочно отмеряющая и штампующая короткие дцРНК с заданным размером и определенными структурными особенностями. Затем Dicer передает короткие РНК другим комплексам, содержащим белки семейства Argonaute *. На следующем этапе происходит расплетание дуплекса коротких РНК, одна из цепей которого обнаруживает в клетке комплементарные ей молекулы РНК (мишени), в результате чего белок Argonaute катализирует подавление их экспрессии. На данный момент известно несколько молекулярных механизмов, с помощью которых может подавляться экспрессия мишеней при РНК-интерференции: белок Argonaute обладает способностью разрезать РНК-мишень, а также блокировать трансляцию матричной РНК. Кроме того, в некоторых случаях комплексы коротких РНК с белками Argonaute могут подавлять непосредственно транскрипцию (синтез РНК) гена-мишени в клеточном ядре.* Белки названы “Argonaute”, поскольку первая из описанных мутаций в соответствующих генах у растений приводила к необычной форме листьев, напоминавших щупальца головоногих моллюсков - аргонавтов.Большинство клеточных РНК не содержат протяженных двуцепочечных участков, поэтому дцРНК в определенном смысле - чужеродная для клетки форма РНК. Какова же естественная роль РНК-интерференции в природе и для чего сам организм использует эту систему? Уже сразу после открытия Файера и Мэллоу возникло предположение, что механизм РНК-интерференции нужен для противодействия РНК-вирусам, которые образуют молекулы дцРНК на некоторых жизненных стадиях. Кроме того, оказалось, что РНК-интерференция направлена на подавление активности подвижных “эгоистических” генов (так называемых мобильных генетических элементов), перемещения которых в геноме, как правило, вредны для организма, поскольку приводят к мутациям и хромосомным перестройкам. Было обнаружено, что транскрипция мобильных элементов действительно может приводить к образованию молекул дцРНК. По-видимому, аппарат РНК-интерференции возник в процессе эволюции как защитная система организма, действующая на уровне нуклеиновых кислот.Короткие РНК участвуют также и в регуляции клеточных матричных РНК. У нематоды С.elegans еще задолго до открытия Файера и Мэллоу была найдена эндогенная короткая (22 нуклеотида) РНК lin-4, останавливающая трансляцию комплементарной матричной РНК на определенной стадии эмбрионального развития. Это рассматривалось как уникальный для нематоды механизм подавления трансляции. После обнаружения коротких РНК в процессе РНК-интерференции стало понятно, что РНК lin-4 может вырезаться из дцРНК-предшественника также с помощью белка Dicer, что действительно было показано. С 2002 г. у различных видов животных и растений были выявлены сотни видов эндогенных коротких РНК (так называемые микроРНК), которые образуются из “дцРНК-шпилек”, формирующихся при транскрипции генов микроРНК. К настоящему времени установлены функции лишь нескольких десятков типов микроРНК (т.е. идентифицированы регулируемые с их помощью гены-мишени). Так, выяснилось, что микроРНК участвуют в формировании осей тела и дифференцировке тканей в раннем онтогенезе у нематоды, дрозофилы и человека, направляют образование нервной системы у рыб и определяют форму листьев у растений. Даже эти примеры показывают, сколь велико может оказаться значение микроРНК в процессах развития. Теоретически около трети всех матричных РНК человека могут быть мишенями микроРНК, что позволяет ограничивать экспрессию многих белков в определенных типах клеток на той или иной стадии онтогенеза. Не удивительно, что нарушение “работы” некоторых микроРНК, согласно исследованиям последних трех лет, может стать причиной развития опухолей.
Таким образом, за восемь лет, прошедших с момента публикации Файера и Мэллоу, изучение РНК-интерференции получило чрезвычайно бурное развитие. Сразу же после открытия РНК-интерференцию стали применять в качестве мощного и удобного способа специфического подавления экспрессии генов для выяснения их функций. В этом случае используются “экзогенные” дцРНК или короткие РНК, которые могут быть синтезированы in vitro или же транскрибироваться с интегрированных в геном конструкций. В наши дни РНК-интерференция стала одним из наиболее популярных подходов в функциональной геномике, в том числе для массового скрининга генов.
По словам Файера, Грааль в РНК-интерференции - это терапевтический потенциал коротких РНК. Такая терапия основана на древнем и консервативном механизме регуляции генов, используемом организмом, в том числе и для защиты от вирусов. Уже разрабатываются технологии лечения с помощью РНК-интерференции (правда, пока на мышах и других модельных млекопитающих): короткие РНК оказались эффективны против вирусов иммунодефицита человека и гепатита С. Получены данные, позволяющие надеяться, что короткие РНК можно будет использовать для терапии нейродегенеративных, кардиоваскулярных и эндокринных заболеваний, а также рака. Лечение с помощью коротких РНК, направленное на подавление лишь одного гена, качественно отличается от всех других методов терапии рака (например, химиотерапии), направленных в основном на уничтожение раковых клеток и имеющих множество побочных эффектов.
© Кленов М.С.,
кандидат биологических наук
Институт молекулярной генетики РАНЛитература
1. Fire A.Z., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. // Nature. 1998. №391. P.806-811.
2. Izant J.G., Weintraub H. // Cell. 1984. №36. P.1007-1015.
3. Hamilton A.J., Baulcombe D.C. // Science. 1999. №286. P.950-952.
4. Лауреаты нобелевской премии 1993 года. По физиологии и медицине - Р.Робертс и Ф.Шарп // Природа. 1994. №1. С.110-111.
5. Bernstein E., Caudy A. A., Hammond S. M., Hannon G.J. // Nature. 2001. №409. P.363-366.
6. MacRae I.J., Zhou K., Li F. et al. // Science. 2006. V.311. №5758. P.195-198.
