VIVOS VOCO: С.В. Разин, "Пространственная организация ДНК"

Пространственная организация ДНК

С.В. Разин

Сергей Владимирович Разин, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук,
заведующий лабораторией структурно-функциональной организации хромосом в Институте биологии гена РАН,
профессор кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Еще в начале прошлого века благодаря использованию чисто генетических методов выяснилось, что гены линейно расположены на хромосомах. С тех пор большинство исследователей рассматривают геном как цепь последовательно расположенных генов и межгенных участков, включающих различные регуляторные и другие (казалось бы незначимые) последовательности. Такой стереотип мышления отражается, в частности, в том, что расстояния между генами или другими участками ДНК обычно указывают в тысячах нуклеотидных пар, имея в виду расстояния вдоль молекулы ДНК.

Хотя это вполне корректно, но такое представление о линейности генома заключает в себе определенные опасности. Дело в том, что в ядре эукариотической клетки геном упакован чрезвычайно сложно. В результате последовательности ДНК, в том числе и гены, отстоящие друг от друга на десятки или сотни тысяч нуклеотидных пар, а иногда и вообще расположенные в разных хромосомах, в трехмерном пространстве оказываются в непосредственной близости. Это обеспечивает взаимодействие белковых комплексов, связанных с удаленными (если считать вдоль молекулы ДНК) регуляторными элементами. Такие взаимодействия значительно расширяют возможности работы различных регуляторных систем в геноме эукариотической клетки. В последние годы получено несколько принципиально новых наблюдений, существенно повысивших интерес к пространственной организации ДНК в ядре. Мы попытаемся суммировать современные достижения в этой области.

Упаковка ДНК в ядре

В средней эукариотической клетке общая протяженность геномной ДНК составляет около 2 м, диаметр ее ядра всего ~10-20 мкм. При этом совокупность генов, работающих в данной клетке, должна быть доступна для РНК-полимераз и транскрипционных факторов, а вся ДНК в делящихся клетках должна реплицироваться.

Сегодня известно, что упаковка ДНК в ядре эукариотической клетки осуществляется в несколько этапов (рис.1). Сначала нить ДНК укладывается в нуклеосомы, при этом ее длина уменьшается в шесть-семь раз. Затем нуклеосомная нить складывается в так называемую 30 нм фибриллу (соленоид или зигзагообразную нить), что обеспечивает дополнительную компактизацию в 40 раз. Далее фибрилла организуется в большие (50 и более тысяч пар нуклеотидов) петли, концы которых закрепляются на белковом скелете ядра (его часто называют ядерным матриксом). На этом этапе линейные размеры ДНК сокращаются в 700 раз [1]. Существуют и следующие уровни компактизации ДНК, информация о которых в настоящее время весьма скудна и противоречива.

Рис. 1. Уровни упаковки ДНК в ядре эукариотической клетки.

Пока речь шла лишь об упаковке одной протяженной молекулы ДНК. В первом приближении таковой можно считать ДНК одной хромосомы. Однако геном эукариотической клетки разделен на несколько хромосом. Например, в клетках любимого объекта генетиков - плодовой мушки дрозофилы - имеется четыре пары хромосом (в клетках человека их 46). Индивидуальные хромосомы можно увидеть под микроскопом только во время митоза. На остальных фазах клеточного цикла они не видны, и ядро клетки представляется относительно гомогенным. В течение многих лет молекулярных биологов интересовал вопрос, занимают ли отдельные хромосомы ограниченные пространства внутри ядра или же при декомпактизации хромосом ДНК каждой из них распределяется по всему ядру, неизбежно перемешиваясь с ДНК других хромосом.

Рис. 2. Окраска хромосомных территорий.

А - ДНК метафазных хромосом человека. Б - ДНК интерфазного ядра. В - ДНК метафазных хромосом (синий цвет) после гибридизации с хромосом-специфичными пробами, узнающими хромосому 18 (красный цвет) и хромосому 19 (зеленый цвет); показаны два гомолога соответствующей хромосомы. Г - результаты гибридизации ДНК интерфазных ядер с хромосом-специфичными пробами, узнающими хромосомы 18 и 19. Восемь секций ядра сделаны с помощью конфокального микроскопа; синим окрашена вся ядерная ДНК (как на рис.Б).

Около 10 лет назад ответ на этот вопрос был найден. Методы молекулярной гибридизации позволили окрашивать в интерфазном ядре индивидуальные хромосомы (рис.2). Оказалось, что они, вопреки общепринятой в то время точке зрения, занимают внутри ядра ограниченные неперекрывающиеся пространства (названные "хромосомными территориями", рис.3) и располагаются неслучайным образом: хромосомы, богатые генами, локализуются ближе к центру ядра, а бедные генами - ближе к его периферии [2]. В поддержании специфических позиций хромосомных территорий важную роль играет ядерный матрикс.

Рис. 3. Двумерная и трехмерная модели ядра, показывающие расположение хромосомных территорий [2].

Взаимодействие удаленных регуляторных элементов

Упаковка ДНК в иерархические хроматиновые структуры принципиально важна для физического расстояния между регуляторными последовательностями и их ориентации в пространстве. А эти последовательности всегда служат площадками связывания регуляторных белков. Уже организация ДНК в нуклеосомы может сделать эти площадки недоступными для белковых факторов, либо ориентировать их так, что посаженные на них белковые комплексы в силу чисто стерических причин (например, направленности в противоположные стороны) не смогут взаимодействовать друг с другом. А при формировании фибрилл возможности подавления либо активации тех или иных регуляторных систем возрастают. Однако расположение нуклеосом на ДНК достаточно динамично. Обратимые изменения в их структуре и степени конденсации хроматина (в частности, переход от развернутой нуклеосомной нити к 30 нм фибрилле и более компактным гетерохроматиновым структурам) составляют наиболее изученную часть эпигенетических механизмов.

Эти механизмы мы не будем обсуждать, а остановимся на следующем уровне упаковки ДНК в хроматине, а именно на протяженных петлях ДНК (рис.1). Их можно увидеть при электронной микроскопии метафазных хромосом и интерфазных ядер, из которых были удалены гистоны. Наличие в интерфазных ядрах топологически замкнутых петель ДНК продемонстрировано и с помощью биохимических методов [4].

Прикрепленные к ядерному матриксу петли ДНК заинтересовали специалистов прежде всего потому, что по своим размерам они могли бы соответствовать функциональным единицам генома. Для проверки этого предположения требовалось изучить специфичность организации ДНК в петли. Во-первых, установить, одинаково ли разделение генома на петли во всех клетках. Если это предположение верно, то одни фрагменты генома всегда должны находиться в основаниях петель ДНК, а другие - в самих петлях. Во-вторых, выяснить, имеются ли некие особые последовательности ДНК, ответственные за "заякоривание" петель на белковом матриксе ядра.

Метод разрезания генома

За последние 30 лет предложено несколько методов картирования участков прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу (хромосомному остову). Хотя эти методы различаются в деталях, их можно разделить на две принципиально различающиеся группы. Первая основана на выделении так называемой "прилежащей к ядерному матриксу ДНК" (т.е. находящейся в основаниях петель) и фракции петель ДНК, которая отщепляется от ядерного матрикса при ограниченной обработке ядер ферментом нуклеазой (рис.4). Предпочтительное присутствие исследуемого фрагмента ДНК в прилежащей ядерному матриксу фракции, полученной после достаточно интенсивной нуклеазной обработки, позволяет говорить о том, что он прикреплен к ядерному матриксу. Вторая группа методов направлена на изучение специфичности последовательностей ДНК, взаимодействующих с ядерным матриксом. В основе всех методов лежит избирательное связывание in vitro (т.е. в пробирке) фрагментов клонированной ДНК с изолированным ядерным матриксом. Однако результаты, полученные с помощью двух методических подходов, оказались достаточно противоречивыми [4].

Рис. 4. Схема установления позиций генов в петлях ДНК.

А - нуклеоид, полученный после экстракции гистонов из ядер, не обработанных нуклеазой; одна из петель ДНК содержит три гена: "a" находится в проксимальной (по отношению к ядерному матриксу) части петли, "b" занимает промежуточное положение, и "c" - в дистальной части;
Б - после обработки ядер нуклеазой образуются примерно два разрыва на петлю; фрагменты ДНК, находящиеся в основаниях петель (внутри пунктирного круга), прикреплены к ядерному матриксу. После дифференциального центрифугирования фрагменты разделяются, и в прикрепленной к ядерному матриксу ДНК остаются гены "a" и "b";
В - после дополнительной обработки нуклеазой остается только ген "а".

Мы обратили внимание, что все методы направлены на идентификацию и характеристику фрагментов ДНК, локализованных в основаниях петель. В основе нашего принципиально нового подхода лежит разрезание всего генома на петли и последующая их характеристика. На первый взгляд, разделить геном на индивидуальные петли чрезвычайно трудно. Здесь очень важно, с помощью какого инструмента делать разрывы в основаниях петель ДНК. По счастью, таким инструментом нас обеспечила сама природа. Исследования показали, что один из главных компонентов ядерного матрикса - фермент ДНК-топоизомераза II, регулирующий топологию ДНК. Этот фермент вносит двунитевые разрывы в ДНК, которые после снятия топологических напряжений либо разделения катенанов зашиваются (лигируются) тем же ферментом. На протяжении всей реакции фермент, состоящий из двух субъединиц, остается связанным с ДНК.

Существует целый ряд ингибиторов ДНК-топоизомеразы II (в нашем случае VM-26), которые останавливают реакцию на стадии промежуточного комплекса фермент-ДНК. (Интересно, что большинство из них используются в качестве противоопухолевых агентов.) При этом каждая из субъединиц фермента остается ковалентно связанной с 5ў-концом разорванной цепи ДНК. Если такие блокированные комплексы обработать денатурирующим агентом, после чего разрушить фермент, то получится препарат ДНК, разрезанный на фрагменты в местах контакта ДНК с ферментом (рис.5). Если бы топоизомераза II находилась только в ядерном матриксе, то простая обработка живых клеток ее ингибиторами разрезала бы весь геном по участкам прикрепления ДНК к ядерному матриксу. Однако задача осложняется тем, что этот фермент в растворимой форме присутствует в нуклеоплазме и может вносить разрывы в любом месте (если окажется рядом с ДНК в момент обработки клеток ингибитором). Наиболее вероятными точками разрывов будут свободные от нуклеосом участки, наиболее чувствительные к ДНК-нуклеазе (ДНКазе I). Чтобы исключить возможность разрывов вне интересующих нас участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу, мы экстрагировали растворимый фермент, а заодно и гистоны, обрабатывая ядра 2M NaCl (рис.4). Полученные так называемые нуклеоиды обрабатывали ингибиторами ДНК-топоизомеразы II [5]. Так нам удалось разрезать весь геном на отдельные петли и их олигомеры.

Рис. 5. Схема метода картирования петель ДНК:

А - реакция, катализируемая ДНК-топоизомеразой II, и механизм разрезания ДНК при ингибировании сшивающей активности фермента VM-26 и другими "топоизомеразными ядами";
Б - разрезание геномной ДНК на индивидуальные петли. После удаления гистонов развернутые петли ДНК все еще прикреплены к ядерному матриксу (желтые кружки), содержащему ДНК-топоизомеразу II (фиолетовые кружки). Нуклеоиды инкубируют в среде с VM-26, после чего лизируют додецилсульфатом натрия (SDS). В местах прикрепления петель к ядерному матриксу топоизомераза II разрезает ДНК;
В - в петлях ДНК, обработанных рестриктазой Sfi I, появляются разрывы. Фрагмент Sfi I-Sfi I (показан синим цветом) можно идентифицировать с помощью гибридизации с пробой, комплементарной одному из концов полноразмерного рестриктного фрагмента (синяя стрелка). Справа тот же участок генома после дополнительного разрыва, вызванного топоизомеразой II (фиолетовый кружок). Размер укороченного фрагмента равен расстоянию от участка расщепления ДНК-рестриктазой Sfi I до участка расщепления ее топоизомеразой II;
Г - типичная картина результата электрофореза. На всех дорожках виден полноразмерный Sfi I-Sfi I фрагмент ДНК. В дорожках, содержащих ДНК из нуклеоидов, обработанных высокими концентрациями VM-26, появляется дополнительный (Sfi I-Тopo II) фрагмент, который свидетельствует, что внутри изучаемого фрагмента ДНК находится участок прикрепления к ядерному матриксу.

Что делать дальше? Как установить позиции концов петель на физической карте генома? Напомним, что на такой карте показаны реальные расстояния вдоль молекулы ДНК между теми или иными маркерами. Физические карты различных геномов начали создавать задолго до расшифровки геномов человека и ряда других организмов. В качестве маркеров при создании таких карт обычно используются участки расщепления ДНК ферментами рестриктазами. Установить позиции участка прикрепления петли ДНК к ядерному матриксу на физической карте - значит определить расстояние от места прикрепления до места расщепления ДНК той или иной рестриктазой. Для этого можно воспользоваться методом непрямого мечения концов фрагментов ДНК [6], предложенным около 30 лет назад для картирования позиций участков гиперчувствительности к ДНКазе I.

Принцип этого метода заключается в том, что после внесения в ДНК разрывов тем или иным агентом (в нашем случае - ДНК-топоизомеразой II ядерного матрикса) препарат дополнительно разрезают избранной рестриктазой. После разделения фрагментов с помощью электрофореза и переноса их на нитроцеллюлозный фильтр проводят гибридизацию с пробой, комплементарной концу вырезанного фрагмента, внутри которого может находиться дополнительный разрыв. Если такого разрыва нет, то после гибридизации получится полноразмерный фрагмент. Но если внутри этого фрагмента ДНК была разрезана топоизомеразой II ядерного матрикса или другим ферментом, фрагмент будет более коротким, и длина его равна расстоянию от участка расщепления ДНК рестриктазой до участка расщепления ДНК изучаемым агентом (рис.5). При работе с петлями, вырезанными ДНК-топоизомеразой II, основная трудность заключается в необходимости разделить по размеру очень длинные фрагменты ДНК. Эту проблему можно решить, используя электрофорез в пульсирующем поле, который позволяет разделить фрагменты ДНК с размерами от нескольких тысяч до нескольких миллионов нуклеотидных пар [7].

Карта организации в петли-домены гена дистрофина человека

Мы с успехом использовали вышеописанный метод для картирования границ петель в ряде областей генома человека и дрозофилы. После этого была поставлена масштабная задача - построить карту организации в петли-домены самого протяженного из известных генов - гена дистрофина человека. В этом гене, расположенном на Х-хромосоме, около 2500 тыс. нуклеотидных пар, а размер его мРНК составляет всего 14 тыс. нуклеотидных пар. Иначе говоря, более 99% от общей протяженности гена занимают некодирующие последовательности (интроны). В гене дистрофина часто происходят различные перестройки, некоторые из которых приводят к тяжелым наследственным заболеваниям - мышечным дистрофиям [8].

Рис. 6. Карта организации в петли гена дистрофина человека.

Вверху - схема расположения участков и областей прикрепления ДНК к ядерному матриксу (горизонтальные линии, обозначенные номерами 1-8) в границах гена дистрофина. Вертикальные стрелки (латинские буквы A-I) указывают на расположение участков расщепления; горизонтальные - на позиции гибридизационных проб.
Внизу - схема визуализации уникальных фрагментов ДНК на препаратах нуклеоидов. После экстракции из ядер гистонов петли ДНК расправляются и образуют корону вокруг ядерного матрикса (a). Препараты гибридизуют с пробами, содержащими биотин (жирная полоса на схеме б). Такую пробу можно увидеть после окраски антителами, связанными с флуоресцентным красителем (черные кружочки на схеме в).

Карту расщепления гена дистрофина рестриктазой SfiI построили еще до определения полной нуклеотидной последовательности генома человека. Мы картировали позиции участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу относительно точек расщепления ДНК этой рестриктазой и выяснили, что в гене дистрофина имеется по меньшей мере девять петель, разделенных восьмью зонами прикрепления [9]. В некоторых случаях протяженность участков ДНК, разделяющих две соседние петли, сопоставима с длиной самих петель (рис.6, а). Это принципиально новое наблюдение позволило рассматривать зоны прикрепления ДНК к ядерному матриксу как особую часть генома. Любопытно, что именно тут находятся выявленные ранее в гене дистрофина горячие точки рекомбинации [9]. Обнаруженная закономерность оказалась справедливой и для ряда других изученных генов. Еще одно интересное наблюдение (также подтвержденное на других экспериментальных моделях) состоит в том, что в зонах прикрепления петель располагаются участки, с которых начинается репликация ДНК. Это подтверждает сформулированное нами еще 20 лет назад положение о важнейшем принципе организации эукариотической хромосомы - ее построении из структурно-функциональных доменов, соответствующих репликационным единицам [10].

Петли ДНК под микроскопом

Экспериментальный подход, использованный нами для картировании петель ДНК, основан на ряде логических предпосылок, вытекающих из радиально-петлевой модели строения хромосомы. До недавнего времени не было прямых доказательств того, что петли ДНК, картированные с помощью разных методов, именно те, которые можно видеть на цитологических препаратах. Среди множества переплетающихся петель ДНК, наблюдаемых под электронным микроскопом, практически невозможно идентифицировать петлю как фрагмент генома, интересующий исследователя. Однако это возможно при анализе петель с более низким разрешением.

Рис. 7. Микрофотографии результатов гибридизации in situ с препаратами ядерных гало (a) с фрагментом человеческого генома - петли ДНК, картированной в гене дистрофина. Эта петля ограничена областями прикрепления к ядерному матриксу 7 и 8. Гибридизация без конкурентной ДНК (б) и в присутствии избытка немеченной фракции повторяющихся последовательностей человеческой ДНК (в).

Если посмотреть на экстрагированные 2M NaCl ядра в флуоресцентном микроскопе (после окраски ДНК тем или иным флуоресцентным красителем), то можно видеть корону петель ДНК в виде облака, окружающего более ярко окрашенную центральную зону (ядерный матрикс) (рис.7, а и схемы на рис.6). Такие препараты называют ядерными гало (nuclear halos), на которых индивидуальные петли неразличимы. Чтобы увидеть их, надо воспользоваться методом гибридизации in situ (в данном случае препаратов иммобилизованных на стекле ядерных гало) с интересующим фрагментом генома. Проба должна содержать аналоги нуклеотидов (например биотинилированный уридин), которые после гибридизации окрашиваются флуоресцентными красителями, например красным или зеленым. Это позволяет одновременно анализировать распределение ДНК, которую проще всего окрасить DAPI (4’,6-диамидино-2-фенилиндолом) в сиреневый цвет, и распределение пробы после гибридизации, окрашенной в красный или зеленый цвет.

В ходе реализации программы по секвенированию генома человека в разных лабораториях клонировали тысячи протяженных (100-300 тыс. нуклеотидных пар) фрагментов ДНК человека. Большинство клонов систематизировали соответственно позициям клонированных фрагментов ДНК в геноме человека. Существует целый ряд научных центров, в которых можно приобрести интересующий клон. Мы взяли клонированный фрагмент человеческой ДНК, представляющий картированную нами в гене дистрофина петлю ДНК, ограниченную участками прикрепления 7 и 8 (см. рис.6). После гибридизации этого фрагмента с препаратами ядерных гало выявляется множество сигналов, распределенных по всему полю (рис.7, б). Это связано с тем, что в ДНК высших эукариот, в том числе и человека, присутствует множество повторяющихся последовательностей, распределенных по всему геному.

Имеющиеся в нашей пробе повторы гибридизуются со всеми комплементарными последовательностями. Понятно, что результаты такого эксперимента не поддаются интерпретации. К счастью, сигналы от гибридизации повторяющихся последовательностей можно подавить. Для этого мы провели гибридизацию в присутствии избытка немеченой фракции повторяющихся последовательностей ДНК человека и увидели петли ДНК, прикрепленные к ядерному матриксу (рис.7, в). Все они имели одинаковый размер (в пределах погрешности измерений), соответствующий длине фрагмента ДНК, картированного в экспериментах по вырезанию петель ДНК-топоизомеразой II ядерного матрикса [9].

Значение этого результата выходит за рамки простого подтверждения правильности построенной нами карты доменной организации гена дистрофина. Впервые в мире мы показали, что биохимический метод, основанный на радиальной модели строения хромосомы, действительно позволяет картировать петли ДНК, наблюдаемые на цитологических препаратах. Это подтверждает и радиальную модель строения хромосомы, на основании которой разработан наш метод вырезания петель. Далее, возможность наблюдать одинаковые петли ДНК при анализе ряда препаратов ядерных гало подтверждает тот факт, что ДНК организована в петли статично, т.е. во всех клетках к ядерному матриксу прикреплены одни и те же фрагменты ДНК, а участки между ними образуют петли. Мы поставили эксперимент на активно делящихся клетках. Коль скоро во всех клетках выявлены одинаковые петли ДНК, можно утверждать, что специфическая организация ДНК в петли, разделенные зонами прикрепления, сохраняется в ряду клеточных делений. Это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку позволяет рассматривать такую организацию ДНК как один из эпигенетических механизмов. Действительно, при образовании петель могут фиксироваться позиции различных регуляторных элементов и их мишеней, способствуя их взаимодействию либо, наоборот, исключая его.

Петли ДНК, хромосомные перестройки и эволюция генома

Как мы уже говорили, горячие точки рекомбинации гена дистрофина находятся в сегментах, прикрепленных к ядерному матриксу. Дополнительные исследования показали, что к ядерному матриксу прикреплены и горячие точки рекомбинации, присутствующие в ряде других генов, в частности тех, рекомбинации которых ассоциированы с развитием лейкозов [11]. Трудно поверить, чтобы это было просто случайным совпадением. Скорее всего, именно постоянный контакт ДНК с топоизомеразой служит причиной возникновения "горячих точек" хромосомных перестроек. Топоизомераза II может прямо участвовать в незаконной рекомбинации. Еще более вероятно, что внесенные ею двунитевые разрывы в ДНК при определенных условиях могут стимулировать неточное восстановление этих повреждений.

Известно, что репарация двунитевых разрывов в ДНК высших эукариот нередко приводит к различным рекомбинационным событиям. На возможную роль топоизомеразы II как индуктора хромосомных перестроек указывают многочисленные данные о том, что использование ингибиторов этого фермента в химиотерапии опухолей нередко вызывает вторичные лейкозы [12]. Клетки этих лейкозов характеризуются различными крупномасштабными хромосомными изменениями, наиболее частыми в участках расщепления ДНК-топоизомеразой II [13]. Важно отметить, что участки прикрепления петель на молекуле ДНК располагаются достаточно далеко друг от друга, но внутри ядра они могут оказаться в непосредственной близости. Незаконная рекомбинация между такими участками будет приводить к утрате либо перемещению протяженных участков генома, что, в свою очередь, может быть важным фактором эволюции генома [14].

Литература

1. Getzenberg R.H., Pienta K.J., Ward W.S., Coffey D.S. // Journal of Cellular Biochemistry. 1991. V.47. P.289-299.

2. Cremer T., Kurz A., Zirbel R., Dietzel S. et al. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1993. V.58. P.777-792.

3. Peterson C.L., Laniel M.A. // Curr. Biol. 2004. V.14. P.R546-551.

4. Razin S., Gromova I.I., Iarovaia O.V. // International Review of Cytology. 1995. V.162B. P.405-448.

5. Razin S.V., Hancock R., Iarovaia O., Westergaard O. et al. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1993. V.58. P.25-35.

6. Nedospasov S.A., Georgiev G.P. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. V.92. P.532-539.

7. Schwartz D.C., Cantor C.R. // Cell. 1984. V.37. P.67-75.

8. Hoffman E.P., Schwartz L. // Mol. Aspects Med. 1991. V.12. P.175-194.

9. Iarovaia O.V., Bystritskiy A., Ravcheev D., Hancock R. et al. // Nucl. Acids. Res. 2004. V.32. P.2079-2086.

10. Razin S.V., Kekelidze M.G., Lukanidin E.M., Scherrer K. et al. // Nucl. Acids Res. 1986. V.14. P.8189-8207.

11. Iarovaia O.V., Shkumatov P., Razin S.V. // J. Cell. Sci. 2004. V.117. P.4583-4590.

12. Super H.J., McCabe N.R., Thirman M.J., Larson R.A. et al. // Blood. 1993. V.82. P.3705-3711.

13. Zhang Y., Strissel P., Strick R., Chen J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V.99. P.3070-3075.

14. Razin S.V. // Crit. Rev. Eukar. Gene Exp. 1999. V.9. P.279-283.